* Antagandet att alla karaktärer är heterosexuella. Detta är uppenbart på sättet som karaktärerna talar om kärlek och relationer, och på sättet att de interagerar med varandra. Till exempel, när Viola klär ut sig till en man, antas hon omedelbart vara kär i Orsino, trots att hon aldrig har träffat honom.
* Framställning av samkönade begär som onaturligt eller komiskt. Detta syns tydligast i karaktären av Sir Andrew Aguecheek, som ständigt drar skämt om sin attraktion till män. Hans önskan tas inte på allvar av någon, och han blir ofta förlöjligad för det.
* Det faktum att pjäsen slutar med ett traditionellt heterosexuellt äktenskap. Detta förstärker tanken att heterosexualitet är den enda acceptabla formen av sexuell läggning.
Uttrycket av heteronormativitet i Twelfth Night är problematiskt eftersom det marginaliserar och utesluter icke-heterosexuella personer. Det skapar också ett klimat där det är svårt för icke-heterosexuella personer att vara öppna med sin sexuella läggning.