Florey föddes i Adelaide, södra Australien, son till en rektor. Han gick på St Peter's College, Adelaide och University of Adelaide, där han tog examen med en kandidatexamen i naturvetenskap 1921 och en doktorsexamen i medicin 1924.
Efter att ha avslutat sin medicinska examen arbetade Florey på Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research i Melbourne, där han träffade Ernst Chain. 1928 flyttade de till Sir William Dunn School of Pathology vid University of Oxford, där de började arbeta med utvecklingen av penicillin.
Penicillin hade upptäckts 1928 av Alexander Fleming, men det hade inte utvecklats till ett användbart läkemedel. Florey and Chain lyckades isolera den aktiva ingrediensen i penicillin och rena den så att den kunde injiceras i patienter. De utvecklade också metoder för att masstillverka penicillin, vilket gjorde det möjligt att använda det brett under andra världskriget.
Florey och Chains arbete med penicillin räddade otaliga liv under andra världskriget och revolutionerade behandlingen av infektionssjukdomar. Florey tilldelades Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1945, och han adlades 1944.
Florey var också en framstående administratör och utbildare. Han var vice rektor vid University of Oxford 1959 till 1962, och han var president för Royal Society of London 1960 till 1965. Han var också stipendiat vid Australian Academy of Science, American Academy of Arts and Sciences och National Academy of Sciences.
Florey dog av en stroke i Oxford 1968. Han anses vara en av de viktigaste australiensiska forskarna på 1900-talet, och hans arbete med penicillin har räddat miljontals liv.