Huvudrollen:
* Phineas Flynn: Den uppfinningsrike, energiske storebrodern. Röst av Vincent Martella.
* Ferb Fletcher: Den tyste, fyndiga lillebrodern. Röst av Thomas Sangster.
* Candace Flynn: Deras storasyster som är besatt av att slå dem för deras galna uppfinningar. Röst av Ashley Tisdale.
* Näbbdjuret Perry: Phineas och Ferbs näbbdjur, som i hemlighet arbetar som hemlig agent för O.W.C.A. (Organisation utan en cool akronym). Röst av Dee Bradley Baker.
* Dr. Heinz Doofenshmirtz: Den onde vetenskapsmannen som bor tvärs över gatan och ständigt försöker ta över Tri-State Area. Röst av Dan Povenmire.
* Isabella Garcia-Shapiro: Phineas' crush, en medlem av Fireside Girls. Röst av Alyson Stoner.
* Buford Van Stomm: Den tuffe och lite fördomsfulla översittaren. Röst av Bobby Gaylor.
* Baljeet Tjinder: Phineas och Ferbs intelligenta och ofta nervösa vän. Röst av Maulik Pancholy.
* Jeremy Johnson: Candace's crush, en populär pojke. Röst av Mitchel Musso.
* Phineas och Ferbs mamma: En kärleksfull och stödjande mamma. Röst av Caroline Rhea.
* Phineas och Ferbs pappa: En tillbakalutad och ofta omedveten pappa. Röst av Richard O'Brien.
Återkommande tecken:
* Större monogram: Perrys chef på O.W.C.A. Röst av Jeff "Swampy" Marsh.
* Ombud P: Perrys hemliga agent kodnamn.
* Stacy Hirano: Candaces bästa vän, som ofta är skeptisk till Candaces försök att slå Phineas och Ferb. Röst av Kelly Hu.
* The Fireside Girls: En grupp tjejer som alltid är ivriga att hjälpa Phineas och Ferb. Röst av Alyson Stoner, Ashley Tisdale och andra.
* The Evil Sidekick: Doofenshmirtz töntiga assistent. Röst av Dee Bradley Baker.
* Vanessa Doofenshmirtz: Doofenshmirtz tonårsdotter, som vanligtvis skäms över sin fars skurkaktiga upptåg. Röst av Olivia Olson.
* Norm: Doofenshmirtz robotbutler.
* Berättaren: En mystisk röst som berättar många av avsnitten. Röst av Dee Bradley Baker.
Den här listan täcker de flesta av huvudkaraktärerna, men Phineas och Ferb är kända för sin stora ensemblebesättning och sina många återkommande karaktärer, så det finns många fler karaktärer som skulle kunna listas!